· poliakrilamidasgelis turi būti sudarytas iš akrilamido monomero, polimerizacijos pradinės medžiagos, katalizatoriaus ir druskos bei buferio mišinio.
· akrilamidasir BIS (N, N'-metileno dvigubas akrilamidas) yra monomero formos gelio matrica.
· amonio persulfatas pradeda klijų polimerizacijos procesą. Klijų formulei reikalingas 10 % amonio persulfato tirpalas, paruoštas vandenyje. Daugumoje informacijos nurodoma, kad reikia aktyviai naudoti. Tačiau 10 % tirpalą galima laikyti 4 ℃ temperatūroje kelias savaites be reikšmingo aktyvumo praradimo. Praskieskite iki 10 ml ir išpilkite, kai klijai nesulimpa.
Patarimas: procentinė dalisakrilamidasSekvenavimo klijai ir baltymų klijai nėra tas pats. Jei naudojate paruoštą akrilamido:BIS tirpalą, įsitikinkite, kad turite tinkamą buteliuką.
· TEMED (N, N, N', N'- tetrametiletilendiaminas) yra katalizatorius, supilamas į rudą butelį, dedamas į šaldytuvą. Įpilamas prieš pat pilant klijus.
· Poliakrilamido elektroforezėje naudojamas stiklas turi būti plaunamas prieš ir po kiekvieno elektroforezės karto. Po elektroforezės nuplaukite minkštu šepečiu ir šluoste karštame muiluotame vandenyje, nuskalaukite distiliuotu vandeniu ir palikite išdžiūti.
· drėgmė ir dulkės gali pažeisti tuščiavidurį polimerą. Prieš elektroforezę stiklo plokštelę nuvalykite stiklo valikliu ir nuvalykite minkštu šepečiu. Nuplaukite distiliuotu vandeniu ir kruopščiai nusausinkite popierine servetėle. Prieš valydami popierine servetėle, perskalavimas 70 % etanoliu padeda išvalyti ir pagreitinti džiūvimą. Akrilamido mėginius pilkite iš eilės: BIS, vandenį, buferinį tirpalą, amonio persulfatą, TEMED. Gerai suplakite ir nedelsdami supilkite.
Prieš polimerizaciją poliakrilamido degazuoti nebūtina. (Akrilamidas anksčiau būdavo dedamas į vakuumą, kad būtų pašalinti burbuliukai, nes deguonis slopina polimerizaciją.)
Horizontalių klijų taškų pavyzdžių antgaliai.
· Į apatinę dėžutę įdėkite juodo popieriaus lapą, juodame fone padarykite pavyzdinę skylutę, kad aiškiau matytumėte.
· klijų bako pripildytas buferis, tiesiai virš koloido.
· Jei kraštas šviečia, įjunkite šviesą, leiskite šviesai šviečiant koloidinei šviesai. Įtraukite mėginį į pipetę.
· naudojant automatinį pipetės įtaisą.
· 10–200 μM tirpale daugumoje mėginio taškų galima naudoti 1 skysčio judėjimo tašką. Labai mažoms mėginio skylutėms (mažesnėms nei 10 μM) patogesnė ilga pipetės galvutė, naudojama klijų sekvenavimui.
· pipete lašinant ką tik panardintą į mėginį, įkvepiant lėtai judantį skystį. Mėginys gali atrodyti lipnus dėl glicerino, o greitas pumpavimas gali įtraukti oro burbuliukų į pipetės galvutę.
· Įkvėpus mėginius pipetės galvute, švelniai judinkite skysčio galvutę vamzdžio kraštu arba valykite popierių, siurbdami skysčio galvutę už lašelių ribų. Būkite atsargūs ir neįsiurbkite mėginio.
Įdėkite mėginį į mėginio angą
· pipetės įtaisas palaiko nedidelį slėgį, kad mėginiai šiek tiek judėtų perpildymo skysčio galvute.
· pipetės galvutė įkišta į buferį, šiek tiek aukščiau nei taškinės skylutės, palaiko teigiamą slėgį. Pipetės galiuką galima įkišti į mažą skylutę.
· lėtai ir tolygiai ištraukite mėginius. Pipetės galiukas uždedamas virš mėginio angos, ir mėginys į ją įsminga. Leiskite mėginiui įsmingti, kad užpildytų mėginio angą, o ne stumti.
· Kai paskutinis mėginio lašas pateks į skysčio galvutę, skystis pereis į antrąją koją, lėtai kelkite skysčio judėjimą, ištraukite buferį
Kaip atlikti vertikalią klijų mėginių ėmimą?
· vertikalios klijų taško mėginio skylės, suformuotos tarp dviejų stiklo gabalų. Naudojant labai ploną klijų sluoksnį, pipetės galvutės net neįmanoma įkišti tarp dviejų stiklo plokščių. Saugokitės glicerino! Uždėkite pipetės galvutę ant mėginio skylės ir mėginys į ją įgrims.
· Prieš uždėdami mėginį, būtinai uždėkite vertikalų polipropileno acilo gelio tašką. Mėginio anga yra švariai nuplaunama. Nuplaukite nepolimerizuotą akrilamidą ir vandenį, kuris gali pasirodyti mėginio angos apačioje. Vanduo gali žymiai sumažinti mėginio angą. Naudokite 25 ml arba 50 ml švirkštą ir 18 kalibro adatą. Supilkite elektroforezės buferį ir atsargiai praplaukite mėginio angą.
· gali būti sunku pamatyti mėginio skylutę, bet visa kita yra lengva. Jei skylučių perteklius, mėginio buferį galima patikrinti bromfenolio mėlynuoju.
Įrašo laikas: 2023 m. kovo 31 d.